Массовое параллельное профилирование выявляет тысячи скрытых вирусных белков и консервативных механизмов
Учёные из Института Брода Массачусетского технологического института и Гарварда с помощью метода массивного параллельного рибосомного профилирования (MPRP) обнаружили 4208 ранее неаннотированных открытых рамок считывания (ОРС) в 679 вирусных геномах, связанных с человеком.
Многие вирусы содержат участки, не фиксируемые традиционными методами аннотации. Кроме типичных белок-кодирующих регионов, в их геномах могут находиться короткие или нетипичные ORF, не начинающиеся с стандартного старт-кодона ATG.
Эти фрагменты влияют на вирусную репликацию, иммунные реакции и генную регуляцию. Однако их поиск невозможен с помощью одних только вычислительных алгоритмов. Ранее применявшиеся методы, включая стандартное рибосомное профилирование, зависели от систем культивирования, соответствующих биобезопасности патогенов.
Исследование под названием «Открытие панвирусных ОРС с использованием массивного параллельного профилирования рибосом», опубликованное в Science, описывает подход, при котором анализировались синтетические последовательности, полученные из вирусных геномов. Для этого использовались 20 170 олигонуклеотидов, соответствующих 200-нуклеотидным фрагментам, экспрессированным в клеточных линиях HEK293T и A549. Фрагменты представляли собой участки диких или модифицированных последовательностей, направленных на 5′-нетранслируемые области и стартовые позиции аннотированных генов.
Экспрессия проводилась как через кэп-зависимые, так и через IRES-зависимые механизмы в условиях, моделирующих вирусный стресс. Данные показали высокую воспроизводимость как в пределах одной клеточной линии (коэффициент корреляции Пирсона 0,92 между запусками HEK293T), так и между линиями HEK293T и A549 (0,89).
С помощью MPRP было выявлено 5381 транслируемое ORF, из них 4208 ранее не аннотировались и имели неканонический характер. Рибосомные отпечатки в основном фиксировались в районе стартовых кодонов, включая многочисленные нестандартные старты, и демонстрировали характерную тринуклеотидную периодичность.
Каждый ORF исследовался с использованием трёх синтетических фрагментов: один содержал участок дикого типа, второй — мутацию AUG→GCC, третий — удлинение выше по потоку. Потеря сигнала в мутанте подтверждала точку инициации трансляции.
Также были идентифицированы сотни верхних ORF (uORF) с характерными рибосомными остановками, что указывает на угнетение основной трансляции.
Сопоставление с данными по естественным инфекциям показало высокое совпадение профилей. Синтетические последовательности точно воспроизводили рибосомные сигналы вирусов, включая грипп A и вирус гепатита C. Был также обнаружен внутренний ORF в рамке +1 гена M1 вируса гриппа у разных штаммов, включая H5N1.
Дополнительный анализ показал, что некоторые из новых ORF связаны с распознаванием иммунной системой. В пептидомных данных обнаружили семь пептидов, происходящих от недавно идентифицированных ORF, из них шесть связывались с молекулами HLA-I. Включение этих участков в анализ увеличило общее число пептидов HCMV на 7,4%. Несколько из них продемонстрировали более высокий выход по сравнению с каноническими белками.
Чтобы изучить, как uORF влияют на экспрессию белков, проводился повторный эксперимент с использованием арсенита натрия для активации фосфорилирования eIF2α — ключевого элемента в регуляции трансляции при стрессе. В этих условиях рибосомы обходили ингибирующие uORF и переключались на основные кодирующие последовательности. Такое поведение соответствовало известным механизмам ответа на стресс.
Результаты свидетельствовали о наличии механизма, при котором вирусы используют uORF для координации синтеза белков с фазами состояния клетки-хозяина. Это позволяет временно приостанавливать трансляцию до ослабления иммунной защиты или активации репликационного комплекса.
Разработанный метод позволяет быстро выявлять кодирующие участки в вирусах, включая трудно культивируемые штаммы. Обнаружение ранее неизвестных белков расширяет возможности изучения иммунных реакций и регуляторных механизмов, а также ускоряет разработку вакцин.
Источник: phys.org
Многие вирусы содержат участки, не фиксируемые традиционными методами аннотации. Кроме типичных белок-кодирующих регионов, в их геномах могут находиться короткие или нетипичные ORF, не начинающиеся с стандартного старт-кодона ATG.
Эти фрагменты влияют на вирусную репликацию, иммунные реакции и генную регуляцию. Однако их поиск невозможен с помощью одних только вычислительных алгоритмов. Ранее применявшиеся методы, включая стандартное рибосомное профилирование, зависели от систем культивирования, соответствующих биобезопасности патогенов.
Исследование под названием «Открытие панвирусных ОРС с использованием массивного параллельного профилирования рибосом», опубликованное в Science, описывает подход, при котором анализировались синтетические последовательности, полученные из вирусных геномов. Для этого использовались 20 170 олигонуклеотидов, соответствующих 200-нуклеотидным фрагментам, экспрессированным в клеточных линиях HEK293T и A549. Фрагменты представляли собой участки диких или модифицированных последовательностей, направленных на 5′-нетранслируемые области и стартовые позиции аннотированных генов.
Экспрессия проводилась как через кэп-зависимые, так и через IRES-зависимые механизмы в условиях, моделирующих вирусный стресс. Данные показали высокую воспроизводимость как в пределах одной клеточной линии (коэффициент корреляции Пирсона 0,92 между запусками HEK293T), так и между линиями HEK293T и A549 (0,89).
С помощью MPRP было выявлено 5381 транслируемое ORF, из них 4208 ранее не аннотировались и имели неканонический характер. Рибосомные отпечатки в основном фиксировались в районе стартовых кодонов, включая многочисленные нестандартные старты, и демонстрировали характерную тринуклеотидную периодичность.
Каждый ORF исследовался с использованием трёх синтетических фрагментов: один содержал участок дикого типа, второй — мутацию AUG→GCC, третий — удлинение выше по потоку. Потеря сигнала в мутанте подтверждала точку инициации трансляции.
Также были идентифицированы сотни верхних ORF (uORF) с характерными рибосомными остановками, что указывает на угнетение основной трансляции.
Сопоставление с данными по естественным инфекциям показало высокое совпадение профилей. Синтетические последовательности точно воспроизводили рибосомные сигналы вирусов, включая грипп A и вирус гепатита C. Был также обнаружен внутренний ORF в рамке +1 гена M1 вируса гриппа у разных штаммов, включая H5N1.
Дополнительный анализ показал, что некоторые из новых ORF связаны с распознаванием иммунной системой. В пептидомных данных обнаружили семь пептидов, происходящих от недавно идентифицированных ORF, из них шесть связывались с молекулами HLA-I. Включение этих участков в анализ увеличило общее число пептидов HCMV на 7,4%. Несколько из них продемонстрировали более высокий выход по сравнению с каноническими белками.
Чтобы изучить, как uORF влияют на экспрессию белков, проводился повторный эксперимент с использованием арсенита натрия для активации фосфорилирования eIF2α — ключевого элемента в регуляции трансляции при стрессе. В этих условиях рибосомы обходили ингибирующие uORF и переключались на основные кодирующие последовательности. Такое поведение соответствовало известным механизмам ответа на стресс.
Результаты свидетельствовали о наличии механизма, при котором вирусы используют uORF для координации синтеза белков с фазами состояния клетки-хозяина. Это позволяет временно приостанавливать трансляцию до ослабления иммунной защиты или активации репликационного комплекса.
Разработанный метод позволяет быстро выявлять кодирующие участки в вирусах, включая трудно культивируемые штаммы. Обнаружение ранее неизвестных белков расширяет возможности изучения иммунных реакций и регуляторных механизмов, а также ускоряет разработку вакцин.
Источник: phys.org
